Fases del proceso de clonación
Independientemente del vector y de la célula hospedadora, el proceso de clonación se desarrolla en 3 fases:
- Fase 1: creación del vector recombinante.
- Fase 2: introducción del vector recombinante en la célula hospedadora.
- Fase 3: selección e identificación de los clones que portan la secuencia de interés.
1. Creación de un vector recombinante
Un vector recombinante es aquel que contiene un inserto de ADN extraño.
Es necesario preparar el ADN que se va a clonar y el vector de clonación, de manera que puedan unirse. Para ello, es necesario crear extremos cohesivos y complementarios en los extremos de ambas moléculas.
Preparación del ADN que se va a clonar
Lo habitual es dotar a un ADN bicatenario de extremos cohesivos mediante enzimas de restricción.
Se parte del ADN genómico completo de un organismo purificado y se digiere con una enzima de restricción que sea compatible con el vector y que no tenga una diana de restricción en el interior de la secuencia que se quiere clonar.
Esta digestión genera múltiples fragmentos, alguno con la secuencia de interés. Para asegurarse de que contiene la secuencia de interés, se realizan experimentos de clonación con diferentes enzimas de restricción. Este método es útil para generar librerías genómicas, pero no para amplificar un único gen de secuencia concreta, porque se van a generar tantos vectores recombinantes como fragmentos del tamaño adecuado genere la digestión.
Si se quiere clonar una secuencia específica es preferible la PCR: las polimerasas sin actividad correctora (Taq) generan amplicones con una A exacta en 3′, pudiendo insertarse en vectores con T desaparecido en sus 3′ (vectores –T).
Preparación del vector de clonación
Consiste en digerir el vector con la enzima de restricción usada en el ADN que se va a clonar.
- Vector circular, con diana de restricción única: plásmidos. Tras el tratamiento enzimático, el vector se transforma en una molécula lineal con extremos cohesivos.
- Vector circular con 2 dianas de restricción: YAC. Se obtienen 2 moléculas con extremos cohesivos; una grande, con los marcadores genéticos de selección e identificación, y otra pequeña sin información de interés y que será sustituida por el ADN extraño.
- Vector lineal con diana de restricción única: se divide en 2 fragmentos o brazos, izquierdo y derecho, con un extremo romo y otro cohesivo.
- Vector lineal con 2 dianas de restricción: fago lambda. Se obtienen 2 brazos, izquierdo y derecho, con un extremo romo y otro cohesivo, y una región central con ambos extremos cohesivos.
La región central no se requiere para la clonación y será sustituida por el ADN extraño. Los brazos portan los marcadores de selección e identificación.
Inserción del ADN extraño en el vector
Se realiza mezclando ambas moléculas en las concentraciones adecuadas e incubándolas en condiciones óptimas para que se unan a través de los extremos cohesivos mediante complementariedad de bases, en presencia de una ADN ligasa.
La ligasa sella covalentemente las mellas de la doble hélice de ADN (ligación); se obtiene una mezcla compleja de moléculas, una con el vector recombinante específico y productos no deseados.
Todos estos productos se introducirán en las células hospedadoras y habrá que irlos eliminando en fases posteriores de la clonación.
2. Introducción del vector en la célula hospedadora
Transformación bacteriana
Consiste en la captación e internalización por parte de una bacteria de moléculas de ADN desnudo presentes en el medio externo.
No todas las bacterias pueden realizar este proceso, solo aquellas “competentes”.
Es habitual utilizar métodos de transferencia para introducir plásmidos recombinantes y vectores lineales en bacterias.
La especie más utilizada es la E. coli, pero no es competente de forma natural: hay que transformarla en competente.
El método más habitual consiste en un tratamiento químico (CaCl2) y físico (choque térmico), que aumenta la permeabilidad de la pared y la membrana celular, facilitando la incorporación del vector recombinante. Al finalizar, las bacterias se siembran en placas con el medio de cultivo sólido adecuado para seleccionar las recombinantes.
Transfección
Similar a la transformación pero en células eucariotas.
Consiste en la introducción de vectores recombinantes en células eucariotas no mediada por virus, mediante métodos basados en la utilización de agentes químicos.
Se puede añadir el vector recombinante en una solución tamponada de fosfato cálcico sobre un cultivo de células en monocapa. El vector coprecipita junto con el fosfato cálcico sobre las membranas celulares y es introducido en el interior de la célula por endocitosis.
Otro método se basa en incluir el vector en el interior de liposomas. Estos se fusionan con las membranas celulares y liberan su contenido al interior de la célula.
Transducción
Consiste en la introducción de material genético extraño en una célula por la acción de virus.
El vector recombinante se empaqueta dentro de la cápside de un virus con el que se infecta un cultivo de células hospedadoras: cultivos bacterianos con fagos recombinantes o cósmidos empaquetados en fagos.
En el caso de fagos lambda recombinantes y cósmidos con secuencias cos en los extremos, el empaquetamiento se consigue mezclando el vector recombinante con las proteínas de la cápside vírica, de manera que de forma natural se originan partículas víricas que contienen vectores del tamaño adecuado. Al infectar, los viriones introducen el material genético que contienen (vector).
Si el vector es un fago recombinante, se desencadena un ciclo lítico. Si el vector es un cósmido, en el interior de la bacteria se circulariza gracias a los extremos cohesivos (cos) y se comporta como un plásmido.
Determinados virus y retrovirus se utilizan tanto para introducir vectores en células eucariotas vegetales como animales.
Electroporación
Consiste en aplicar cortos pulsos eléctricos de alto voltaje a una mezcla de células hospedadoras en suspensión y vectores recombinantes en solución: aumentan la permeabilidad de las membranas, permitiendo el paso de los vectores al interior de la célula.
Es un método de gran eficiencia, aplicable en todo tipo de células hospedadoras.