Sondas de Ácidos Nucleicos: Tipos, Características y Aplicaciones

Factores que Afectan la Hibridación

A) Agentes Desnaturalizantes

Algunos agentes desnaturalizantes y solventes orgánicos, como el dimetilsulfóxido (DMSO) y la formamida, desestabilizan los puentes de hidrógeno entre las bases complementarias, facilitando su ruptura. Si se añaden estos compuestos al híbrido en solución, se requiere menos energía para desnaturalizarlo, por lo que la curva de fusión se desplaza hacia la izquierda y la Tm disminuye.

B) Fuerza Iónica de la Solución

Las moléculas de ácidos nucleicos y, en este caso, los híbridos tienen una carga eléctrica neta negativa por los fosfatos dispuestos en la periferia de la doble hélice. Los cationes monovalentes presentes en la disolución se disponen rodeando los híbridos y neutralizando su carga negativa. Este fenómeno estabiliza la doble hélice, puesto que disminuye la repulsión electrostática entre las dos cadenas cargadas negativamente. En consecuencia, cuanto mayor es la concentración de cationes monovalentes en la solución más energía en forma de calor hay que aportar al híbrido para desnaturalizarlo. Esto se refleja en la curva de fusión, que se desplaza hacia la derecha cuando se aumenta la concentración de cationes monovalentes, aumentando la Tm.

C) Porcentaje de Bases No Complementarias o Mismatch

Dependiendo de las condiciones en que se realice la hibridación, una sonda puede unirse tanto a su secuencia diana como a secuencias parecidas a la diana que tengan algunas bases distintas no complementarias. Es decir, se pueden formar híbridos imperfectos que mantienen un número reducido de bases desapareadas y, por tanto, contienen menor número de puentes de hidrógeno que los híbridos perfectos. El porcentaje de pares de bases no complementarias en el híbrido o mismatch es otro factor que influye en la Tm: a mayor mismatch menor Tm.

Especificidad y Sensibilidad de las Sondas

La especificidad es la capacidad que tiene una sonda para discriminar la secuencia diana con la que se tiene que hibridar. El tamaño mínimo de la secuencia de una sonda para que sea específica debe ser de 16 bases. La sensibilidad es la probabilidad de detectar cantidades mínimas del híbrido sonda-diana y está en relación con el número de moléculas marcadoras que admite la sonda.

Tipos de Sondas de Ácidos Nucleicos

Sondas de ADN mediante PCR

La obtención de sondas de ADN mediante PCR consiste en amplificar el fragmento que nos interesa como sonda mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Este método implica conocer las secuencias que flanquean el fragmento que queremos utilizar.

Características:

  • Son bicatenarias.
  • Tienen un tamaño intermedio (cientos de bases).

Sondas de ADN Recombinante

Las sondas de ADN recombinante se obtienen por un proceso de clonación y amplificación por cultivo, que se puede esquematizar de la siguiente manera:

  1. El fragmento de ADN que queremos emplear como sonda se inserta en un vector, normalmente un plásmido bacteriano.
  2. El plásmido recombinante se introduce en una bacteria y se cultiva en un medio apropiado.
  3. Posteriormente se extrae el plásmido amplificado y se emplea entero como sonda, o bien se separa el fragmento de interés con enzimas de restricción.

Características:

  • Son bicatenarias. Esto hace que se requiera desnaturalización por calor como paso previo a la hibridación con las secuencias diana.
  • Tienen un gran tamaño (cientos/miles de pares de bases). Esto hace que admitan gran número de moléculas marcadoras y, por tanto, tienen mayor sensibilidad.
  • No suelen hibridar inespecíficamente, por lo que presentan mayor especificidad.

Sondas de ADN de Síntesis Química

Las sondas de ADN de síntesis química se obtienen por condensación química secuencial de los desoxinucleótidos concretos que interesa incorporar para obtener una secuencia determinada. Actualmente este proceso está automatizado, anclando el primer nucleótido de la secuencia a una fase sólida y añadiendo nucleótido a nucleótido mediante ciclos de reacciones químicas.

Características:

  • Son monocatenarias.
  • Tienen un tamaño reducido. Solo se pueden sintetizar oligonucleótidos relativamente pequeños (<200 nucleótidos) siendo los más habituales inferiores a 40-50 nucleótidos.

Ventajas:

  • Al ser monocatenarias, no requieren desnaturalización por calor durante el proceso de hibridación.
  • Su tamaño reducido les permite una mejor penetración en el tejido, lo cual resulta ventajoso en las técnicas de hibridación in situ, sobre todo para detectar ARNm.

Desventajas:

  • Baja sensibilidad. El tamaño reducido limita el número de moléculas marcadoras que se pueden incorporar, lo que hace que su sensibilidad sea menor respecto a las otras sondas de ADN.
  • Tienen gran facilidad para hibridar inespecíficamente con secuencias parecidas a la secuencia diana, por lo que la hibridación tiene que hacerse en condiciones muy estrictas.

Sondas de ARN

Conocidas también como RIBOSONDAS, son menos utilizadas que las sondas de ADN. Son siempre monocatenarias, por lo que no requieren un paso previo de desnaturalización antes de la hibridación. Tienen como ventaja que los híbridos ADN/ARN son ligeramente más estables que los híbridos ADN/ADN y como inconveniente que los híbridos ADN/ARN son muy sensibles a cualquier contaminación por las ARNasas que las degradan rápidamente. Según el proceso de obtención, las sondas de ARN pueden ser de síntesis química o de transcripción.

Sondas Químicas Sintéticas de Ácidos Nucleicos

Normalmente las sondas utilizadas en las técnicas de hibridación son moléculas de ADN o ARN, pero en la actualidad se están empezando a comercializar como sondas modificaciones químicas sintéticas de los ácidos nucleicos.

Sondas de Ácidos Nucleicos Peptídicos (PNA)

Son oligómeros sintéticos en los que el esqueleto típico de azúcar-fosfato del ADN y ARN es sustituido por un esqueleto formado por unidades de aminoetil-glicina unidas entre sí por enlaces amida. Las sondas PNA hibridan con cadenas de ADN y ARN de secuencia complementaria mediante puentes de hidrógeno entre bases complementarias. Se utilizan principalmente en técnicas de hibridación in situ.

Características:

  • No tienen carga eléctrica, al carecer de grupos fosfato.
  • No son degradadas por nucleasas ni por proteasas, lo que les confiere gran estabilidad.

Ventajas:

  • Hibridan más rápidamente que sus contrapartidas de ADN o ARN.
  • Los híbridos resultantes PNA/ADN o PNA/ARN son más estables que los correspondientes híbridos ADN/ADN o ARN/ARN. Esto es debido a su falta de carga eléctrica, que hace que no exista el efecto de repulsión entre cadenas complementarias.
  • La fuerza iónica del medio influye muy poco en la estabilidad de los híbridos formados con sondas PNA, también debido a su falta de carga.
  • Tienen gran capacidad para discriminar bases no complementarias en la secuencia diana, lo que las hace muy específicas.

Desventajas:

  • Su solubilidad es mucho menor que las de ADN o ADN y disminuye drásticamente con la longitud. Por esta razón, el tamaño de estas sondas no suele sobrepasar las 30 bases.
  • Solo se puede obtener por síntesis química.
Sondas de Ácidos Nucleicos Bloqueados (LNA)

Son oligómeros sintéticos de ribonucleótidos, en los que se modifican químicamente algunas de las ribosas del esqueleto azúcar-fosfato mediante la formación de un puente de oxígeno entre el carbono 2´y el carbono 4´.

Características:

  • Las sondas LNA presentan mayor sensibilidad y especificidad que su contrapartida de ARN sin modificar.
  • Se obtienen por síntesis química.
  • Son de pequeño tamaño.
  • Se usan principalmente en técnicas de hibridación in situ.